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采用真空冷凍干燥法保存微生物(如菌種、病毒等)或生物系統(tǒng)(如血液細(xì)胞、角膜等)是目前便捷的一種方法。由于凍干藥品呈多孔狀、可長(zhǎng)期貯存、復(fù)水性好，且可恢復(fù)活性，因此冷凍干燥技術(shù)廣泛應(yīng)用于制備固體蛋白質(zhì)藥物、口服速溶藥物及藥物包埋劑脂質(zhì)體等。從國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)得知，目前國(guó)內(nèi)已有注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素α2b、凍干鼠表皮生長(zhǎng)因子、外用凍干重組人表皮生長(zhǎng)因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長(zhǎng)激素、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素α2b、凍干人凝血因子VⅢ、凍干人纖維蛋白原等凍干藥品已獲準(zhǔn)上市。
目前認(rèn)為凍結(jié)過程對(duì)細(xì)胞的損傷機(jī)理主要是溶質(zhì)效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞溶液的溫度降到其平衡凍結(jié)點(diǎn)以下一定的過冷度后，細(xì)胞外溶液首先結(jié)晶，純水的凍結(jié)使細(xì)胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮，電解質(zhì)濃度顯著增強(qiáng)，溶液的pH、離子強(qiáng)度、滲透壓發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性以及細(xì)胞脫水死亡，即所謂的溶質(zhì)效應(yīng)。在預(yù)凍過程中，細(xì)胞內(nèi)的水分結(jié)冰，體積膨脹，細(xì)胞內(nèi)的冰晶生長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜產(chǎn)生機(jī)械剪切破壞，稱為機(jī)械效應(yīng)。冷凍速率越快，胞內(nèi)冰晶形成的數(shù)量越多，機(jī)械損傷就越大。此外，凍結(jié)過程對(duì)細(xì)胞凍干效果也至關(guān)重要，如果不能提供有效的預(yù)凍條件，隨后的干燥過程也會(huì)加速細(xì)胞的損傷和死亡。生物制品的玻璃化保存是避免冰晶生長(zhǎng)的主要措施，也是實(shí)現(xiàn)生物體低溫保存的主要途徑。如用海藻糖做保護(hù)劑實(shí)現(xiàn)了紅細(xì)胞的玻璃化保存，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到臨床輸注標(biāo)準(zhǔn)。
真空冷凍干燥過程對(duì)細(xì)胞損傷的兩大根源是細(xì)胞膜的融合與膜脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞膜中的磷脂的極性基團(tuán)通過與水分子結(jié)合而在空間上相互隔開，但細(xì)胞膜失水后，極性基團(tuán)的聚合密度增大，膜上的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與脂類之間發(fā)生相互作用，以極性基團(tuán)間的氫鍵結(jié)合來(lái)補(bǔ)償丟失水分中的氫，導(dǎo)致胞膜融合、破損，內(nèi)容物外溢。這種強(qiáng)烈的相互作用還導(dǎo)致相轉(zhuǎn)變溫度升高，如卵磷脂在水合時(shí)的相轉(zhuǎn)變溫度約為-7℃，而在脫水時(shí)升高至約70℃。故干脂膜在室溫下處于凝膠相，很容易發(fā)生不可逆的相分離，此外，在復(fù)水過程中，處于凝膠相的脂膜會(huì)向液晶相轉(zhuǎn)變，造成膜通透性增加，使細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)自由雙向交換，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂。
所以應(yīng)尋找適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑，一方面具有較高的玻璃化溫度，在凍結(jié)過程中能降低冰晶和溶質(zhì)的損失;另一方面又能在干燥過程中代替水分子穩(wěn)定細(xì)胞膜骨架，保持其完整性。
對(duì)于低溫保護(hù)作用，液體狀態(tài)下蛋白質(zhì)穩(wěn)定的機(jī)理之一是“優(yōu)先排阻”假說(shuō)。該假說(shuō)由Timasheff等首先提出的用以解釋溶液中糖類保護(hù)作用的機(jī)制。他認(rèn)為糖類不直接與生物分子結(jié)構(gòu)相互作用，而是優(yōu)先與其表面的水分子結(jié)合，使得生物分子表面穩(wěn)定劑量濃度比溶液中的低，生物分子優(yōu)先水化，表面張力增加，化學(xué)勢(shì)升高，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定；而保護(hù)劑則優(yōu)先被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外（即優(yōu)先排斥）。專家認(rèn)為溶液中溶質(zhì)(穩(wěn)定劑或去穩(wěn)定劑分子）與生物分子的優(yōu)先相互作用包括優(yōu)先排阻和優(yōu)先結(jié)合。其中優(yōu)先排阻作用穩(wěn)定生物分子結(jié)構(gòu)，優(yōu)先結(jié)合作用破壞生物分子結(jié)構(gòu)。溶質(zhì)對(duì)生物分子穩(wěn)定性的影響取決于優(yōu)先結(jié)合與優(yōu)先排阻作用的平衡，該平衡與溶質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和生物分子的表面性質(zhì)有關(guān)。
“優(yōu)先排阻”假說(shuō)同樣適用于冷凍-融化過程。蛋白質(zhì)保護(hù)劑在溶液中被從蛋白質(zhì)表面排斥，在凍結(jié)過程中能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)。但是優(yōu)先作用機(jī)理不能解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。
在凍干過程中，由于蛋白質(zhì)的水合層被除去，優(yōu)先作用機(jī)理不再適用。對(duì)于凍干保護(hù)機(jī)理，仍在研究探討之中，目前主要有兩種:
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn):自然界中存在的、能夠在低溫脫水狀態(tài)下存活的有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)聚集大量的二糖，常見的為海藻糖和蔗糖，故提出“水替代”假說(shuō)來(lái)解釋二糖的保護(hù)機(jī)理。
該假說(shuō)認(rèn)為由于蛋白質(zhì)分子中存在大量氫鍵，結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接。在冷凍干燥過程中，當(dāng)生物大分子失去結(jié)合水膜后，雙糖分子中的羥基能在其失水部位以氫鍵形式與之連接，及時(shí)形成一層假定的水化膜，這樣可保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，在物理狀態(tài)上保持與結(jié)合水存在時(shí)相似，從而保持了生物分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。另外，二糖的存在還有助于降低脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變溫度T?。
如卵磷脂在蔗糖或海藻糖存在下，T?降低至-20°C，比水合的卵磷脂的T?低10°C，比無(wú)海藻糖干燥的卵磷脂的T?低90°C，這樣干膜脂質(zhì)在室溫下是液晶相，避免了相分離的發(fā)生，且在復(fù)水過程中也不會(huì)發(fā)生相轉(zhuǎn)變和脂質(zhì)雙分子層的泄露。
所謂玻璃化主要是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)(玻璃態(tài))的固化過程。玻璃化固體分子之間的距離與液體分子間的距商沒有區(qū)別、不形成冰晶。研究發(fā)現(xiàn)在玻璃態(tài)下，物質(zhì)兼有固體和流體的行為，黏度高，不容易形成結(jié)晶，且分子擴(kuò)散系數(shù)很低，因而可將細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)分子支撐包裹起來(lái)，形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰相似的碳水化合物玻璃體，使蛋白質(zhì)物質(zhì)的鏈段運(yùn)動(dòng)受阻，阻止蛋白質(zhì)的伸展和沉淀，維持蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而起到保護(hù)作用。
該假說(shuō)認(rèn)為玻璃化是在凍干過程中保護(hù)生物材料的要求。玻璃化能夠在凍結(jié)過程中避免形成冰晶，從而可避免冰晶和溶質(zhì)損傷等凍結(jié)損傷;其次，處于玻璃態(tài)的物質(zhì)具有高的黏度，一般為10¹²~10¹? Pa·s，當(dāng)玻璃化的保護(hù)劑包圍在生物分子的周圍時(shí)，大分子物質(zhì)的分子運(yùn)動(dòng)和分子變性反應(yīng)變得非常微弱，阻止了膜融合等由分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)造成的損傷。所以為最大限度保持細(xì)胞的活性，應(yīng)保證細(xì)胞在整個(gè)凍干過程中始終處于玻璃態(tài)，即低凍結(jié)溫度和干燥溫度應(yīng)始終低于系統(tǒng)的玻璃化溫度T’g。T’g較高的糖類和高聚物有海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖等，其中海藻糖的T’g較高，對(duì)凍干產(chǎn)品的保護(hù)作用更強(qiáng)，保存時(shí)間更長(zhǎng)。
對(duì)于細(xì)胞的保護(hù)，氫鍵和玻璃化都是必需的，所以兩個(gè)假說(shuō)并不互相排斥。舉個(gè)典型的例子具有較高T’g，葡萄糖能夠與膜基團(tuán)直接相互作用，單獨(dú)使用時(shí)均不能阻止干態(tài)下脂質(zhì)膜的泄漏，但兩者的組合使用能有效地保護(hù)脂質(zhì)膜。所以，在血液細(xì)胞的冷凍干燥保存中宜采用二糖和高聚物組合作為凍干保護(hù)劑。
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